Itachi nació dentro del Clan Uchiha, siendo el hijo mayor del líder del clan, Fugaku Uchiha y de su esposa Mikoto Uchiha. Él siempre fue considerado y elogiado como el mejor en su generación, un genio por encima de todos los demás. Incluso sobrepasaba las expectativas de un miembro experto del Clan Uchiha. Sin embargo, ni siquiera su familia, amigos o profesores lo podían entender. Cuando sólo tenía cuatro años, Itachi ya había sido testigo de la pérdida de muchas vidas debido a la Tercera Guerra Mundial Shinobi, que lo traumatizaron emocionalmente, al punto de considerar el suicidio, y lo hizo convertirse en un pacifista. A los 7 años, se graduó de la Academia Ninja como el primero en su clase después de sólo un año, por aquel entonces comenzó a sentir interés por el origen de la aldea, dominó el Sharingan a la edad de 8 años, pasó los exámenes Chūnin a los 10 años, y se convirtió en capitán de las unidades ANBU a los 13 años.
Él fue muy elogiado por su padre, que veía el futuro de la familia en Itachi, por lo que descuidó a su hijo menor, Sasuke Uchiha. Sin embargo, durante este tiempo Itachi mostró gran afecto hacia su hermano pequeño, e incluso animó a su padre para ir a la ceremonia de Inscripción de Sasuke a la Academia, algo que su padre había olvidado diciendo que tenía una importante misión para establecer a Itachi en las filas ANBU.
Cuando el Clan Uchiha comenzó a planear el golpe de estado para derrocar Konoha, Itachi, como ANBU, recibió el encargo de espiar a la aldea. Sabiendo que un golpe de Estado sólo conduciría a una nueva guerra ninja, Itachi comenzó a espiar a los Uchiha en su lugar, transmitiéndole información al Tercer Hokage y a los otros ancianos de Konoha. Durante este tiempo él comenzó a actuar de forma extraña con su clan, ya que no asistía a las reuniones del clan, hablaba en contra del ideal del clan y además fue considerado el principal sospechoso por la muerte de su mejor amigo, Shisui Uchiha, quien se había ahogado en el Río Nakano para proteger su Sharingan de Danzo. Debido a esto, el clan había perdido sus esperanzas en Itachi, y su padre comenzó a cambiar su enfoque a Sasuke en su lugar. Mientras tanto, los intentos del Tercer Hokage de negociar un final pacífico de las hostilidades entre las dos partes resultaron ineficaces; así, contra los deseos del Tercero, Danzo Shimura junto al Consejo de Konoha, le ordenó a Itachi exterminar a todo el Clan Uchiha. Itachi accedió con la única condición de que su hermano no fuera lastimado, justificando que deberá ser un Uchiha el que lo ajusticie en un futuro por el genocidio del Clan.
Sasuke intentó atacarlo por lo que despierta su Sharingan por primera vez, pero Itachi logró esquivar sus ataques. Cuando Itachi estaba recogiendo su banda ninja la cual se le había caído, él derrama lágrimas frente a su hermano. Luego procedió a incapacitar a Sasuke, quien despertó en el hospital recordando todo lo que quería que él hiciera. Desde ese momento Sasuke juro vengarse de él y poder restablecer la gloria del Clan Uchiha. Itachi dejó el pueblo como un traidor. Según Tobi, Itachi también tenía una novia, Izumi Uchiha, a quien mató durante la Masacre del Clan Uchiha.
Itachi se asoció con Kisame Hoshigaki, que en un principio recibió amenazas después de que éste trató de intimidarlo. Sin embargo, finalmente se convirtieron en buenos socios quienes compartían el vínculo común de haber traicionado a las personas más cercanas a ellos. En algún momento después de unirse a Akatsuki y que Orochimaru huyera, Itachi ayudó a reclutar a Deidara a la fuerza, en una batalla utilizando sólo genjutsu. Por esto, Deidara juró venganza contra Itachi, entrenando su ojo izquierdo para evitar volver a caer en un genjutsu de Itachi, y a su vez entrenó otros aspectos como jutsus para vencerlo.
En algún momento, Itachi contrajo una enfermedad mortal. Se mantenía vivo a través de diversos medicamentos como el Kotarō y pura "fuerza de voluntad", con la esperanza de vivir lo suficiente para morir a manos de Sasuke. De esta enfermedad no se supo hasta que Tobi la mencionó pues en sus apariciones en la serie no mostró ningún síntoma, exceptuando en la pelea con Sasuke.
Primera parte
Búsqueda de Tsunade
Tras la muerte del Tercer Hokage, Itachi decide regresar a Konoha para demostrar a los ancianos de la aldea que él aún sigue con vida y todavía es una amenaza si es que los ancianos de la aldea decidieran aprovechar la muerte de Sarutobi para eliminar a Sasuke. Itachi se infiltra junto con Kisame y justifica su visita con la búsqueda de Naruto Uzumaki y el Kyubi, encontrándose con Asuma Sarutobi y Kurenai Yuhi, que resultan derrotados por la pareja Akatsuki. Poco después hace acto de presencia Kakashi Hatake, que también resulta derrotado. Con la llegada de Might Guy ambos huyen, rechazando según Itachi "comenzar una guerra con toda la aldea". Itachi encuentra a Naruto e intenta llevárselo, pero Sasuke llega en su ayuda. Él encuentra a Itachi e intenta atacarlo con el Chidori pero este lo supera significativamente y lo atrapa en un genjutsu donde le muestra la muerte de su clan continuamente. Según Kishimoto, le repite 100.000 veces en un segundo el asesinato de sus padres. En el último instante Jiraiya entra para salvar a Naruto y a Sasuke.
Itachi termina atormentándolo psicológica y físicamente argumentando que sus "poderes no se comparan con los de él". El fin de Itachi es que Sasuke entienda que debe ser más fuerte para que después de su muerte pueda defenderse por si mismo. Jiraiya intenta atraparlos en el estomago de sapo pero Itachi usa su Amaterasu para poder escapar afirmando que no podía pelear ya que tenía poco chakra. A pesar de que se suponía que Itachi fue a Konoha a capturar a Naruto, la única y verdadera razón por la que Itachi regreso a Konoha después de la muerte del Tercer Hokage, era para recordarle a Danzo y a los ancianos de la aldea que él todavía estaba vivo y que no podían tocar a su hermano menor. Aparece por última vez en la primera reunión Akatsuki mostrada en la historia, pero en la brevedad de su momento no habló.Rescate del Kazekage
La promesa del maestro y la venganza
Itachi continúa trabajando para conseguir a los demás jinchurikis En una reunión descubre que Orochimaru ha sido asesinado por su hermano menor, Sasuke y se le recomienda que esté atento porque seguramente sea el siguiente objetivo de éste. Posteriormente aparece bajo la lluvia en una tormenta, al insinuarle Kisame hosigake que Sasuke murió tras su batalla con Deidara y que él es ahora el último Uchiha, Itachi lo rechaza, alegando que Sasuke sigue con vida.
